A növényi N asszimiláció vizsgálata

Dr. Pécsváradi Attila csoportja

Kutatásaink két abiotikus stresszel, a szárazságstressz és a savas talajokon fellépő alumínium toxicitás élettani hátterének vizsgálatával kapcsolatosak. A gabonafélék fakultatív metabolikus változásokkal reagálnak a kedvezőtlen körülményekre, ennek hatása a C/N anyagcserében is megjelenik. A glutamin szintetáz (GS, EC 6.3.1.2) (a N metabolizmus központi enzime) izoenzimeinek arány és aktivitás változása stressz-indikátor, meghatározott élettani folyamatokat tükröz. Az enzim csaknem valamennyi vizsgált élőlényben előfordul, az ammónia és glutaminsav glutaminná alakítását katalizálja. A primér N asszimiláció kulcsenzime éppúgy mint az ammónia reasszimilációé és detoxifikációé. Az oktamer eukariota GS alegységenként két kétértékű fémiont igényel, ami a fémstresszek potenciális célpontjává teszi az enzimet. A növényi GS két magnézium iont köt az alegységek specifikus fémkötő helyein. A GS aktivitását befolyásolhatják a nehézfémek, de pl. az alumínium szerves komplexei is hatásosak. A C3-as növények levelében a legnagyobb mennyiségben levő fehérjét, a Rubisco-t párhuzamosan mérve kimutattuk ennek a „N raktárnak” a lebontását, a N-remobilizálódást. A szárazságstressz felgyorsítja az a szeneszcenciát a fiatalabb levelekben a kevésbé toleráns fajtákban: az asszimiláló „source” jelleg átalakul degradatív „source”-szá.

Mind a GS aktivitás, mind a fehérjetartalom (Rubisco) esetében növekedő gradiens áll fenn a levélzetben az idősebbtől a fiatal levelek irányába. Tolerancia esetén ennek a gradiensnek csak a  meredeksége változik, érzékeny fajtáknál ez megtörik, a zászlós levél korai szeneszcenciája indul meg, degradatív „source” állapotot a GS izoformák mennyiségi változása és a Rubisco mennyisége egyértelműen jelzik. Az alumínium stressz tolerancia egyik növényekben leírt módja az Al szerves ligandumokhoz kapcsolása, komplexálása.

A glutamin szintetáz szerkezetében két eltérő affinitású fémkötő helyet találunk, melyek az enzim katalitikus és strukturális tulajdonságait határozzák meg. A szerves Al(III)-komplexek jelenlétében felvett kinetikai görbék értékelésével az Al toxikus hatásának a mértéke meghatározható. Kimutatható, hogy aluminiummal kezelt és ezt követően izolált GS enzim specifikus fémkötő helyeinek egyikét az Al elfoglalja és serkentheti a GS aktivitását.
A glutamin szintetáz enzim viselkedését nemcsak stresszhatások indikátoraként tanulmányozzuk. Az enzim fehérje szintű aktivitás regulációja is vizsgálataink tárgya.
A glutamin szintetáz enzim aktivitását többnyire fiatal búza növényekben vizsgáljuk, melyeket hidroponikusan nevelünk ill. kezelünk. Ugyancsak meg tudjuk határozni a molibdén kofaktort tartalmazó enzimek csoportjába tartozó nitrát reduktáz aktivitását is, mely érzékenyen reagál az élettani folyamatok környezet okozta változására.

Kísérleti módszerek, infrastruktúra
Az enzimek aktivitását in vitro fehérjeextraktumokban mérjük. Poliakrilamid gélelektroforézissel szeparálni, ill. western blottal azonosítani tudjuk az enzimfehérjéket. Nem denaturáló gélelektroforézissel az izoenzimek aktivitása a gélben is kimutatható. A kutatáshoz rendelkezésre áll emellett SDS PAGE és izoelektrofókuszálás is.
Főbb műszerek: Uvikon XL (Secomam) kétsugaras spektrofotométer, horizontális Multiphor II (Pharmacia) és vertikális MiniProtean (BioRad) elektroforézis kamrák, Dry strip, nagyfeszültségű tápegységek, hűthető folyadéktermosztát, gélszárító, szkenner; asztali centrifugák.

A témákhoz kapcsolódó publikációk:

Pécsváradi, A., Nagy, Z., Varga, A., Vashegyi, Á., Labádi, I., Galbács, G. and Zsoldos, F.: Chloroplastic glutamine synthetase is activated by direct binding of aluminium. Physiol. Plant. 135: 43-50, 2009.
Fábián, A., Zsoldos, F., Vashegyi, Á., Bóna, L. and Pécsváradi, A.: Experiments on posttranslational regulation of glutamine synthetase activity. 7th International Symposium on Inorganic Nitrogen Assimilation. Wageningen – The Netherlands, June 23-27, 2004. Abstracts, P-11, p: 69, 2004.
Dörnyei, Á., Kilyén, M., Kiss, T., Gyurcsik, B., Laczkó, I., Pécsváradi, A., L. Simon, M., Kotormán, M.: The effects of Al(III) speciation on the activity of trypsin. J. Inorg. Biochem., 97: 118-123, 2003.
Kertész, S., Fábián, A., Zsoldos, F., Vashegyi, Á., Labádi, I., Bona, L. and Pécsváradi, A.: Changes in glutamine synthetase activity in presence of aluminium complexes. VII. Magyar Növényélettani Kongresszus, Szeged, 2002. június 24-27. Abstract. Acta Biol. Szeged. 46(3-4): 103-104, 2002.
Pécsváradi, A., Zsoldos, F., Kertész, S., Vashegyi, Á., Bóna, L., Labádi, I., Kiss, T.: In vitro activation of glutamine synthetase by organic Al-complexes. 6th International Symposium on Inorganic Nitrogen Assimilation. Reims – France, July 8-12,. Abstracts, 3-35. 2001.
Erdei, L., Horváth, F., Tari, I. Pécsváradi, A., Szegletes, Zs., Dulai, S.: Differences in photorespiration, glutamin synthetase and polyamine between fragmented and closed stands of Phragmites australis. Aquatic. Bot. 1462:1-12. 2001.
Zsoldos, F., Vashegyi, Á., Pécsváradi, A. and Bóna, L.: Growth and potassium transport in common and durum wheat as affected by aluminium and nitrite stress. J. Plant Nutrition 24:345-356. 2001.
Pécsváradi, A., Zsoldos, F., Bóna, L., Buchmüller, N., Kertész, S., Vashegyi, Á., and Kiss, T.: Behaviour of organic Al-complexes in GS assay: an in vitro test for Al-stress. Abstract of 12th FESPP Congress, Budapest, Hungary, August 21-25, 2000. Plant Physiol. Biochem. 38:s208. 2000.
Zsoldos, F., Vashegyi, Á., Bóna, L., Pécsváradi, A. and Szegletes, Zs.: Growth of and potassium transport in winter wheat as affected by various Aluminum exposure times. J. Plant Nutrition 23:913-926. 2000.
Zsoldos, F., Vashegyi, Á., Bóna, L., Pécsváradi, A. and Szegletes, Zs.: Aluminium and nitrite induced alteration in potassium transport of wheat. Cereal Res. Commun. 27:147-153. 1999.
Pécsváradi, A., Zsoldos, F., Vashegyi, Á., Bóna, L.: Al-stress affects the GS and NR in wheat. 5th International Symposium on Inorganic Nitrogen Assimilation. Luso – Portugal, July 13-17,. Abstracts, p 151. 1998.
Pécsváradi, A. and Zsoldos F.: Nitrate reductase and nitrite reductase activity in nitrite- and chlorate-stressed rice seedlings. Plant Physiol. Biochem. 34:659-663. 1996.
Schobert, C., Großmann, P., Gottschalk, M., Komor, E., Pécsváradi, A. and z.Nieden, U.: Sieve tube exudate from Ricinus communis L. seedlings contains ubiquitin and chaperones. Planta 196:205-210. 1995.
Zsoldos, F., Vashegyi, Á. and Pécsváradi, A.: Effects of pH and nitrite on potassium uptake and growth of rice seedlings. J. Plant Physiol., 144: 358-361, 1994.
Sakuth, T., Schobert, C., Pécsváradi, A., Eichholz, A., Komor, E., Orlich, G.: Specific proteins in the sieve-tube exudate of Ricinus communis L. seedlings: separation, characterization and in-vivo labelling. Planta 191:207-213. 1993.